Als2 Silencing Affects the Expression of Two NF-κB Targeted Genes via UXT in Adult Mouse Primary Spinal Motor Neuron CultureM. Beyza Çetin Ozansoy1, Mehmet Ozansoy21T.C. Istanbul Medipol University, School of Medicine, Dept. of Physiology, Istanbul, Turkey
2T.C. Istanbul Medipol University, International School of Medicine, Dept. of Physiology, Istanbul, Turkey
Aim: Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder affecting motor neurons. The loss-of-function mutations seen in the Als2 gene lead to ALS. The interaction between alsin, Als2 encoded protein, and UXT has been documented in vitro. UXT is a cofactor in NF-κB pathway. Our aim is to investigate the effect of Als2 silencing in NF-κB in primary motor neurons.
Method: Spinal motor neurons isolated from adult BalbC mice were characterized immunocytochemically by anti-ChAT and anti-βIII tubulin primary antibodies. Als2 was silenced by RNAi and expressions of UXT, A20 and IL8 were determined by qRT-PCR. TNF-α, an NF-κB activator, was also applied and alterations in the expressions of A20 and IL8 were measured. Data were statistically evaluated by Student t-test.
Results: Als2 expression decreased 74.3% by RNAi in immunocytochemically characterized spinal motor neurons (p<0.0001). UXT expression reduced by 40% (p<0.0001), decrease in IL8 expression was 84.4% (p<0.0001), whereas A20 expression increased by 65% (p<0.0001). When TNF-α was applied, IL8 expression increased by 17-fold, but the increase in A20 was only 29.5%.
Conclusion: The gene expressional correlation between Als2 and UXT has been proven. The decreases in Als2 and UXT cause a reduction in IL8 expression, whereas expression of A20 increases. This indicates that Als2 silencing might reduce inflammatory response while activating pro-apoptotic signals. When NF-κB pathway has been activated by TNF-α, a considerable increase in IL8 has been observed. These data provide a confirmation and elaboration of a connection between Als2, UXT and NF-κB pathway in primary spinal motor neurons. Keywords: Als2, spinal motor neuron, UXT, IL8, A20
Als2'nin Susturulmasının NF-κB Hedefli İki Genin Ekspresyonlarına UXT Üzerinden Etkisinin Yetişkin Fare Primer Spinal Motor Nöron Kültüründe AraştırılmasıM. Beyza Çetin Ozansoy1, Mehmet Ozansoy21T.C. İstanbul Medipol Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Fizyoloji Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye
2T.C. İstanbul Medipol Üniversitesi, Uluslararası Tıp Fakültesi, Fizyoloji Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye
Amaç: Amiyotrofik Lateral Skleroz (ALS) motor nöronları etkileyen nörodejeneratif bir hastalıktır. Als2, ALS’ye neden olan genlerden biri olup, mutasyonları alsin proteininde işlev kaybına yol açar. Alsin ile UXT proteininin etkileştiği in vitro olarak gösterilmiştir. UXT NF-κB yolağında bir kofaktördür. Çalışmadaki amacımız Als2 geninin susturulmasının NF-κB yolağı aktivitesine olan olası etkisinin primer spinal motor nöronlarda araştırılmasıdır.
Yöntem: Yetişkin BalbC fare spinal motor nöron kültüründe, nöronlar anti-ChAT ve anti-βIII tubulin primer antikorları ile immünositokimyasal olarak gösterilmiş, Als2 geni RNAi yöntemi ile susturulmuş ve qRT-PCR ile doğrulanmıştır. Als2’nin susturulduğu motor nöronlardaki UXT, A20 ve IL8 gen ekspresyonları qRT-PCR ile belirlenmiştir. NF-κB aktivatörü olan TNF-α kullanılarak A20 ve IL8 ekspresyonlarındaki değişim qRT-PCR ile ölçülmüştür. Verilerin istatistiksel anlamlılığı Student t-test ile değerlendirilmiştir.
Bulgular: İmmünositokimyasal olarak gösterilen spinal motor nöronlarda RNAi ile Als2 gen ekspresyonu %74,3 oranında azaltıldı (p<0,0001) ve UXT ekspresyonunun %40 düştüğü belirlendi (p<0,0001). IL8 seviyesinin %84,4 azaldığı, ancak A20 seviyesinin %65 arttığı gözlendi (p<0,0001). Nöronlara TNF-α uygulandığında IL8 ekspresyonunun 17 kat yükseldiği, ancak A20 ekspresyonunun sadece %29,5 arttığı bulgulandı.
Sonuç: Bu bulgular ışığında Als2 ile UXT arasındaki gen ekspresyonu seviyesindeki korelasyonun sağlaması yapılmıştır. Als2 ve UXT seviyesindeki düşüş IL8 seviyesini azaltırken A20’yi yükseltmektedir. Bu veriler Als2’nin susturulmasının enflamatuar cevabı azaltırken pro-apoptotik sinyalleri A20 üzerinden tetikleyebileceğini düşündürmektedir. TNF-α kullanılarak NF-κB yolağı aktive edildiğinde, IL8 artışı üzerinden gerçekleşen enflamatuar bir cevap görülmektedir. Böylece Als2 ile NF-κB yolağı arasındaki işlevsel bağlantının UXT üzerinden gerçekleştiği ilk kez primer spinal motor nöron kültüründe doğrulanmış olup, IL8 ve A20 gibi NF-κB yolağındaki kilit moleküllerin bu bağlamda rol oynadığı gösterilmiştir. Anahtar Kelimeler: Als2, spinal motor nöron, UXT, IL8, A20
M. Beyza Çetin Ozansoy, Mehmet Ozansoy. Als2 Silencing Affects the Expression of Two NF-κB Targeted Genes via UXT in Adult Mouse Primary Spinal Motor Neuron Culture. Medeniyet Med J. 2018; 33(3): 227-234
Corresponding Author: Mehmet Ozansoy, Türkiye |
|